SMN1基因外顯子缺失檢測(cè)試劑產(chǎn)品審評(píng)現(xiàn)狀
發(fā)布時(shí)間：2018-10-24
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脊髓性肌萎縮癥（spinalmuscularatrophy，SMA）是一種常染色體隱性遺傳病，居兒童致死性常染色體隱性遺傳病的第2位。位于染色體5q11.2～q13.3上的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主要致病基因。
人基因組有兩個(gè)緊鄰的高度同源的SMN基因：端粒側(cè)的SMN1和著絲粒側(cè)的SMN2，兩者僅有5個(gè)堿基不同。SMN1是主要功能基因，該基因突變可導(dǎo)致SMA發(fā)病，SMN2為臨床表型的調(diào)節(jié)基因，影響病情的嚴(yán)重程度，其拷貝數(shù)增加可減輕SMA表型。目前已知約94％的SMA患者為SMN1基因第7和（或）第8外顯子純合缺失所致，少數(shù)病例可由SMN1基因點(diǎn)突變或小的缺失引起。
SMN1基因外顯子缺失檢測(cè)的意義
SMA在人群中的發(fā)病率為1/5000～1/10000，群體攜帶者頻率為1/35～1/50，是出生缺陷的高危因素，因此極有必要進(jìn)行SMA攜帶者的人群篩查，并通過產(chǎn)前診斷技術(shù)降低人群中SMA患兒的出生率。
臨床上將SMA分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即嬰兒型、中間型和少年型，嚴(yán)重程度依次遞減。神經(jīng)專科醫(yī)生一般根據(jù)患者發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)及病情進(jìn)展程度進(jìn)行臨床診斷，輔助檢查方法包括肌電圖、肌酶和肌肉活檢，結(jié)合家族史和SMN1基因分析可進(jìn)行確診。由于SMA患兒中約94%為SMN1基因外顯子純合缺失，因此，SMN1基因缺失檢測(cè)對(duì)于SMA的診斷具有更高的靈敏度和特異性。且對(duì)不同型的SMA患者，SMN1純合缺失率沒有顯著差異，所以，SMN1純合缺失的檢測(cè)對(duì)于不同型SMA患者具有相同的臨床診斷價(jià)值。在歐美人群中，SMN1基因純合缺失檢測(cè)已成為診斷和排除診斷SMA的首選方法。
SMN1基因缺失檢測(cè)試劑的現(xiàn)狀
目前，SMN1基因外顯子缺失檢測(cè)試劑較為缺乏，臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室較為公認(rèn)的方法是PCR結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）的方法。但該方法操作較為繁瑣，且重復(fù)性差，不利于標(biāo)準(zhǔn)化，不易推廣。同時(shí)，這種方法只能檢測(cè)出純合缺失，無法確認(rèn)雜合缺失。
荷蘭的SMAMLPA檢測(cè)試劑可對(duì)待測(cè)靶序列進(jìn)行半定量分析，因此既可檢測(cè)純合缺失，亦可確認(rèn)雜合缺失。在國(guó)內(nèi)外已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道采用該方法進(jìn)行SMA患者診斷和SMA攜帶者篩查。但該產(chǎn)品目前仍為“僅用于研究”的試劑，尚未按照體外診斷類醫(yī)療器械上市（98/79/EC）。
2015年底，原國(guó)家食品藥品監(jiān)管總局批準(zhǔn)了第一項(xiàng)SMN1缺失突變檢測(cè)試劑上市。該產(chǎn)品采用多重實(shí)時(shí)熒光MGB-TaqMan探針PCR法，以人基因組單拷貝基因RPP40為內(nèi)參基因，對(duì)SMN1基因第7外顯子和第8外顯子拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，用于SMA患者的體外輔助分子診斷。SMN1基因外顯子缺失檢測(cè)的難點(diǎn)之一在于排除高同源性基因SMN2的干擾，特別是對(duì)于SMN2高拷貝數(shù)的受試者，需保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。該產(chǎn)品通過對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR相對(duì)定量、絕對(duì)定量技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)整合，并在反應(yīng)體系中加入特定化學(xué)組分，以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶（C）與胸腺嘧啶（T）的錯(cuò)配，增加PCR擴(kuò)增的特異性，從而有效控制SMN2基因非特異性擴(kuò)增對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，準(zhǔn)確檢出高拷貝數(shù)SMN2樣本中SMN1基因第7和第8外顯子的缺失情況。
鑒于國(guó)內(nèi)外尚無任何按照體外診斷試劑批準(zhǔn)上市的SMA分子診斷產(chǎn)品，因此臨床試驗(yàn)方案中依據(jù)EMQN關(guān)于《SMA分子診斷最佳實(shí)踐指南》，采用了國(guó)內(nèi)外SMA體外輔助分子診斷領(lǐng)域公認(rèn)的PCR-RFLP法作為對(duì)照方法。臨床試驗(yàn)共完成1069例，其中正常對(duì)照組777例，SMA病例組292例，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示申報(bào)產(chǎn)品與對(duì)比方法檢測(cè)結(jié)果的一致性為100%（95%置信區(qū)間：99.66%～100%）。此外，9747例正常成年人大樣本中目標(biāo)外顯子△△Ct分布范圍的調(diào)查亦顯示，該產(chǎn)品的純合突變判斷界值設(shè)置合理。
該試劑目前批準(zhǔn)的預(yù)期用途僅包含純合缺失的檢測(cè)，尚不能用于雜合缺失的檢測(cè)，因此無法用于SMA攜帶者的篩查，這是該產(chǎn)品的缺陷之一。
事實(shí)上，該產(chǎn)品在設(shè)計(jì)上已考慮到SMA攜帶者的檢測(cè)，其檢測(cè)原理是以待測(cè)樣本中目標(biāo)外顯子熒光信號(hào)Ct值與內(nèi)參基因熒光信號(hào)Ct值之差（△Ct_s），與正常對(duì)照品三個(gè)梯度稀釋品中目標(biāo)外顯子熒光信號(hào)Ct值和內(nèi)參基因熒光信號(hào)Ct值之差的平均值（△Ct_a）之差，即△△Ct，作為待測(cè)樣本中目標(biāo)外顯子拷貝數(shù)檢測(cè)變量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量的基本數(shù)學(xué)原理推導(dǎo)得到申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)變量△△Ct的計(jì)算公式，依據(jù)這一計(jì)算公式可推導(dǎo)出純合缺失、雜合缺失和野生型的△△Ct理論值（或范圍）；再結(jié)合目標(biāo)外顯子與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率差異以及SMN2不同拷貝數(shù)的影響，可對(duì)上述△△Ct理論值進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示純合缺失、雜合缺失和野生型的△△Ct值（或范圍）之間可設(shè)置合理的判斷界值，因此理論上該產(chǎn)品可分別檢測(cè)出三種基因狀態(tài)。但鑒于生產(chǎn)企業(yè)對(duì)雜合缺失與野生型之間的判斷界值研究尚不透徹，再加上缺乏可判定雜合缺失的對(duì)比方法等其他困難，本次注冊(cè)申請(qǐng)的預(yù)期用途僅限于檢測(cè)純合突變，即SMA患者輔助診斷。
綜上，SMN1基因外顯子缺失檢測(cè)在SMA疾病診斷和SMA攜帶者篩查中具有重要的臨床價(jià)值。然而到目前為止，受到技術(shù)水平的限制，相關(guān)的體外診斷試劑比較缺乏，特別是可用于SMA攜帶者篩查的雜合缺失檢測(cè)，尚無適合的體外診斷試劑上市。（器審中心審評(píng)六部 何靜云）
來源：中國(guó)醫(yī)藥報(bào)
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